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鉴别中药材DNA分子诊断技术前景广阔

发布时间:2005-9-26 23:01:13 作者:未知 来源:不详 阅读:

聽  虽然我国药材种类繁多,资源丰富,但来源复杂,品种混淆情况严重,目前一直运用经典形态分类即生物物种来研究药材来源。这种用形态分类来划分物种的方法建立在个体形态描述和客观观测水平上,因此得到的结论往往不完善,易引起争论。随着生命科学研究的不断突破,DNA分子诊断技术鉴定中药的研究得到了极大的发展,并正逐渐成为中药鉴定的一种方法。由于DNA分子信息量高,所以DNA分子遗传标记鉴别中药材有其独到的优越性。

快速的RAPD法

  随机扩增多态性DNA(RAPD)目前已成功应用于多种中药鉴定中。例如中国中医研究院利用18-24碱基的6种引物进行任意引物PCR(AP-PCR)和10个碱基的OPC-6引物进行RAPD扩增,可区别菊科地胆草属植物苦地胆及其混淆品白花地胆草和假地胆草。南京师范大学生命科学学院遗传资源研究所将该技术用于蛇类动物分类鉴别。中国人民解放军第302医院利用RAPD技术研究了不同地理群体间的遗传分化,从而为药材道地性研究提供了分子水平的支持依据。天津商学院食品与生物工程系利用黄芪根瘤菌的DNA进行同源性分析。此外,红花、贝母属、香菇、厚朴、石斛等均可运用此法进行鉴别。

RAPD技术发展较迅速的主要在DNA提取、数据测序等环节。

  DNA提取目前主要存在两种提取方法,其中CTAB法能很好去除多糖杂质。中南大学科研人员对人参、西洋参运用CTAB法提取DNA时,提高了CTAB裂解液浓度,有利于核酸与蛋白质完全裂解及CTAB-DNA复合物形成,通过增加PVP及β巯基乙醇的含量,防止卜植物油细胞中多酚类物质氧化成色素。在低盐条件下,CTAB-DNA复合物发生沉淀,通过离心可去除多糖类、蛋白质、色素及多酚类成分。

  测序后对数据进行分析,这是判断药物近缘关系的关键一步。中国协和医科大学药用植物研究所利用遗传分化指数(DC)值和分化指数比(PDC)值比较不同类型遗传分化度。无论从树状关系还是遗传分析的结果都能反映出不同种间的亲源关系,同时也表现出内遗传分析上相对一致性。研究人员认为可以通过建立RAPD分子标记数据库,并在此基础上进行样品的判断分析,这也是RAPD技术真正成为中药鉴定手段的有效途径。

准确的基因片段序列

  近年来,生物体中被称为"活化石"的rDNA基因被用作研究科内、属内、种内间的分子系统演化及物种鉴别的重要分子标记。一般认为,rDNA在真核生物中是高度保守的,其编码区(18S,5.8S,26S)的序列具有高度的同源性,在系统上主要用于属于系统学研究,而非编码区(ITSl,ITS2)的序列常用与种间及种下等级的系统学研究。序列可变区包括matk基因编码区和trnk外显子与matk内含子之间区域。例如,中山大学生命科学院采用端终止法对杜仲分子rRNA基因(25SrRNA)5′,端基因进行测序;甘肃中医学院利用5SrRNA基因间隔区序列对当归进行测序;南京师范大学生命科学学院遗传资源研究所利用cytb基因对金银白花蛇及其伪品进行测序等。

可重复的AFLP技术

  AFLP技术是限制内切酶片段长度多态技术(RFLP)与多聚酶链反应(PCR)技术的结合。该技术为新技术。AFLP技术是用一人工接头与限制酶切的基因组DNA片段进行连接,制AFLP模板DNA,合成一系列3′,末端随机改变各碱基的PCR引物进行PCR指纹图谱。中南大学成功的利用AFLP法构建了人参、西洋参基因组DNA指纹图谱。与RFLP、RAPD比较,AFLP法构建DNA指纹图谱具有重复性好、灵敏度高的优点。

问题和展望

  目前,例用DNA分子诊断技术尚存在一些问题。如RAPD方法稳定性受模板、扩增条件等诸多因素的影响,且尚未能构建出真正意义上的数据库;RAPD鉴定微小种子类中药材时,模板DNA中可能含有两种以上植物的DNA,有关两种模板DNA同时存在对扩增结果的影响尚未见报道;DNA分子诊断技术对不同部位入药的药材尚难以区分;对于成药、复方、提取液的DNA标记也未见报道。此外,因DNA分子诊断标记在中药鉴定中成本高,操作实验条件要求严格等因素,也阻碍了该技术的推广。因此,DNA分子诊断技术必然要经历一个不断发展和完善的过程,相信不久DNA分子诊断技术将成为中药鉴定中的重要技术。

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  DNA分子诊断技术有10多种。依据多态性的检测手段分为三类:①限制内切酶片段长度多态技术(RFLP);②基于多聚酶链反应(PCR)的分子标记(PAPD)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任意引物PCR(AP-PCR)、DNA扩增产物指纹DNA(DAF)等;③PCR-RELP技术的结合AFLP技术。根据检测DNA的多态性的方法分两类:一类直接测序DNA序列标记法,一类间接方法反映序列差异。此外,还有依据分析对象分为两类:采用检测基因组DNA多态RAPD、AP-PCR、AFLP;检测特定片段DNA的多态,即以特定的基因(或短片段的DNA)为研究对象。

 

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